二代测序原理：
1、DNA待测文库构建。 超声波把DNA打断成小片段，一般200--500bp，两端加上不同的接头
2、Flowcell。一个flowcell，8个channel，很多接头
3、桥式PCR扩增。每个DNA片段将在各自位置集中成束，每一束含有单个DNA模板的很多拷贝，目的：将碱基的信号强度放大，达到测序所需的信号要求。
4、测序。边合成边测序。反应所需材料，dNTP的3’端特殊处理，不能继续反应，因此每次只能添加一个碱基，另外每个碱基有一种颜色。dNTP添加到链上后，所有未使用游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。
接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，
最后, 利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
双端测序：正义链测100，反义链测100，合起来200，这样测序结果比较准确。
Next generation sequencing (NGS)二代测序数据预处理与分析
常使用的工具列表
- 质量控制Quality Control：FastQC、Fastx-toolkit
- 拼接Aligner：BWA，Bowtie, Tophat, SOAP2
- Mapper：Tophat, Cufflinks
- 基因定量 Gene Quantification: Cufflinks, Avadis NGS
- 质量改进 Quality improvement: Genome Analysis Toolkit(GATK)
- SNP: Unified Genotyper,Glfmultiple, SAMtools, Avadis NGS
- CNV: CNVnator
- Indel: Pindel, Dindel, Unified Genotyper, Avadis NGS
- Mapping to a gene: Cufflinks, Rsamtools, Genomic Features
相关的数据格式
- FASTQ:
- SAM: A generic nucleotide alignment format
- BAM: binary format
- VCF
数据处理的流程
RNAseq数据不容易分析的原因：
- 差异大，0~几万
- 基因多
- 巨大的变异
- 样本量小
- 鉴定SNP可供借鉴的经验
鉴定SNP可供借鉴的经验
如果一个基因中SNP数目超过3个，10个碱基中SNP数目超过2个，这样的SNP就需要怀疑；
通过RNAseq、DNAseq鉴定SNP，有什么区别？
本质没有区别，但是RNAseq时，需要注意可变剪接 造成的SNP。
参考资料：
http://boyun.sh.cn/bio/?p=1862