【转录组】RNA-seq分析htseq-count的使用

HTSeq作为一款可以处理高通量数据的python包，由Simon Anders, Paul Theodor Pyl, Wolfgang Huber等人携手推出HTSeq — A Python framework to work with high-throughput sequencing data。自发布以来就备受广大分析人员青睐，其提供了许多功能给那些熟悉python的大佬们去自信修改使用，同时也兼顾着给小白们提供了两个可以拿来可用的可执行文件 htseq-count（计数） 和 htseq-qa（质量分析）。

这里需要注意的是HTSeq作为read counts的计数软件，承接的是上游比对软件对于clean data给出的比对结果即bam文件（由sam文件sort得到），和HTSeq能行使同样作用的还有类似于GFold，bedtools等软件，我会在最后做一个基本的结果比对。

附manual

附油管视频讲解

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HTSeq的安装

# 创建存放文件夹
mkdir ~/biosoft/HTseq && cd ~/biosoft/HTseq

# download并解压
wget https://pypi.python.org/packages/fd/94/b7c8c1dcb7a3c3dcbde66b8d29583df4fa0059d88cc3592f62d15ef539a2/HTSeq-0.9.1.tar.gz#md5=fc71e021bf284a68f5ac7533a57641ac
tar zxvf HTSeq-0.9.1.tar.gz
cd HTSeq-0.9.1/

#使用python命令安装，此处注意，install --user参数最好用上，除非你可以获取root权限
python setup.py build
python setup.py install --user

# add bin/ to your PATH
vim .bashrc
PATH=/home/path_to/.local/bin:$PATH
source .bashrc

HTSeq使用注意事项

1. HTSeq是对有参考基因组的转录组测序数据进行表达量分析的，其输入文件必须有SAM和GTF文件。
2. 一般情况下HTSeq得到的Counts结果会用于下一步不同样品间的基因表达量差异分析，而不是一个样品内部基因的表达量比较。因此，HTSeq设置了-a参数的默认值10，来忽略掉比对到多个位置的reads信息，其结果有利于后续的差异分析。
3. 输入的GTF文件中不能包含可变剪接信息，否则HTSeq会认为每个可变剪接都是单独的基因，导致能比对到多个可变剪接转录本上的reads的计算结果是ambiguous，从而不能计算到基因的count中。即使设置-i参数的值为transcript_id，其结果一样是不准确的，只是得到transcripts的表达量。

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HTSeq的使用

#这里承接的是上游hisat2比对软件得到的bam文件，sort by pos, 所以需要重新sort

samtools sort -n yourfile.bam > yourfile_name.bam

htseq-count -f bam -r name -s no -a 10 -t exon -i gene_id -m intersection-nonempty yourfile_name.bam ~/reference/hisat2_reference/Homo_sapiens.GRCh38.86.chr_patch_hapl_scaff.gtf > counts.txt

　　

# 命令参数 
-f | --format default: sam 设置输入文件的格式，该参数的值可以是sam或bam。 
-r | --order default: name 设置sam或bam文件的排序方式，该参数的值可以是name或pos。前者表示按read名进行排序，后者表示按比对的参考基因组位置进行排序。若测序数据是双末端测序，当输入sam/bam文件是按pos方式排序的时候，两端reads的比对结果在sam/bam文件中一般不是紧邻的两行，程序会将reads对的第一个比对结果放入内存，直到读取到另一端read的比对结果。因此，选择pos可能会导致程序使用较多的内存，它也适合于未排序的sam/bam文件。而pos排序则表示程序认为双末端测序的reads比对结果在紧邻的两行上，也适合于单端测序的比对结果。很多其它表达量分析软件要求输入的sam/bam文件是按pos排序的，但HTSeq推荐使用name排序，且一般比对软件的默认输出结果也是按name进行排序的。 
-s | --stranded default: yes 设置是否是链特异性测序。该参数的值可以是yes,no或reverse。no表示非链特异性测序；若是单端测序，yes表示read比对到了基因的正义链上；若是双末端测序，yes表示read1比对到了基因正义链上，read2比对到基因负义链上；reverse表示双末端测序情况下与yes值相反的结果。根据说明文件的理解，一般情况下双末端链特异性测序，该参数的值应该选择reverse（本人暂时没有测试该参数）。 
-a | --a default: 10 忽略比对质量低于此值的比对结果。在0.5.4版本以前该参数默认值是0。 
-t | --type default: exon 程序会对该指定的feature（gtf/gff文件第三列）进行表达量计算，而gtf/gff文件中其它的feature都会被忽略。 
-i | --idattr default: gene_id 设置feature ID是由gtf/gff文件第9列那个标签决定的；若gtf/gff文件多行具有相同的feature ID，则它们来自同一个feature，程序会计算这些features的表达量之和赋给相应的feature ID。 
-m | --mode default: union 设置表达量计算模式。该参数的值可以有union, intersection-strict and intersection-nonempty。这三种模式的选择请见上面对这3种模式的示意图。从图中可知，对于原核生物，推荐使用intersection-strict模式；对于真核生物，推荐使用union模式。 
-o | --samout 输出一个sam文件，该sam文件的比对结果中多了一个XF标签，表示该read比对到了某个feature上。 
-q | --quiet 不输出程序运行的状态信息和警告信息。 
-h | --help 输出帮助信息。 

　　

htseq-count 的三种比对模式

union, intersection-strict and intersection-nonempty 对照示意图可以选择自己需要的模式

我这里使用intersection_nonempty

 

mode

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HTSeq的输出

HTSeq将Count结果输出到标准输出，其结果示例如下：

head counts.txt
ENSG00000000003 0
ENSG00000000005 0
ENSG00000000419 1171
ENSG00000000457 563
ENSG00000000460 703
ENSG00000000938 0
ENSG00000000971 1
ENSG00000001036 925
ENSG00000001084 1468
ENSG00000001167 2997

tail count.txt
ENSG00000283696 18
ENSG00000283697 0
ENSG00000283698 1
ENSG00000283699 0
ENSG00000283700 0
__no_feature    3469791
__ambiguous 630717
__too_low_aQual 1346501
__not_aligned   520623
__alignment_not_unique  2849422

　　

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GFold：另一个count matrix的提取工具

GFold是一款2012年同济大学的研究组发表在Bioinformatics 上的软件，旨在通过对于相对基因变化找出RNA-seq中表达差异的基因，同时也可以用作read count的计数。

安装

gfold.V1.1.4.tar.gzdownload解压后即可使用

使用

gfold count -ann hg19Ref.gtf -tag sample1.sam -o sample1.read_cnt
gfold count -ann hg19Ref.gtf -tag sample2.sam -o sample2.read_cnt

　　

输出

output文件包含五列：

#说明很详细，这里不再翻译

GeneSymbol:
For BED file, this is the 4'th column. For GPF file, this is the first column. For GTF format, this corresponds to 'gene_id' if it exists, 'NA' otherwise.

GeneName:
For BED file, this is always 'NA'. For GPF file, this is the 12'th column. For GTF format, this corresponds to 'gene_name' if it exists, 'NA' otherwise.

Read Count:
The number of reads mapped to this gene.

Gene exon length:
The length sum of all the exons of this gene.

RPKM:（#这里需要注意但是双端测序技术还未普及，这里未使用FPKM，况且RPKM和FPKM也不是能很好的代表基因表达水平 ）
The expression level of this gene in RPKM.

　　

output文件示例：

head example.read_cnt
ENSG00000000003 TSPAN6  0   4535    0
ENSG00000000005 TNMD    0   1610    0
ENSG00000000419 DPM1    1588    1207    27.4411
ENSG00000000457 SCYL3   1344    6883    4.07267
ENSG00000000460 C1orf112    1334    5967    4.66292
ENSG00000000938 FGR 0   3474    0
ENSG00000000971 CFH 2   8145    0.0051215
ENSG00000001036 FUCA2   1427    2793    10.6564
ENSG00000001084 GCLC    2462    8463    6.06767
ENSG00000001167 NFYA    5123    3811    28.0378

　　

此处使用示例bam文件or sam文件和HTSeq的输入文件一致，但是结果出入还是较大的，此处仅作说明，不加以推荐。

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Bedtools ：再一个count matrix的提取工具

bedtools是一个极其老牌的数据处理软件了，由犹他大学一个实验室开发，我也是看了生信菜鸟团Jimmy的一篇文章才知道也可以用来计数的。

安装

wget https://github.com/arq5x/bedtools2/releases/download/v2.26.0/bedtools-2.26.0.tar.gz
tar zxvf bedtools-2.26.0.tar.gz

　　

使用

bedtools multicov -bams 1.bam 2.bam 3.bam 4.bam-bed file.bed > read.count.txt

　　

# 注意，此处的bed文件需要自己处理得到的，需要四列，第一列为chrN，第二列第三列为基因位置，第四列为基因名。类似于：
chr1 0   10000   ivl1
chr1 10000   20000   ivl2
chr1 20000   30000   ivl3
chr1 30000   40000   ivl4

　　

输出