MIT molecular Biology 笔记10 翻译

视频  https://www.bilibili.com/video/av7973580/

教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

 

翻译

　　翻译机器的组成

  • mRNA
  • tRNA
  • aminoacyl tRNA synthetase
  • ribosome

一、信使RNA

1、多肽链是由可读框决定的

  • 含有多个ORF的mRNA叫多顺反子
  • 只有1个ORF的mRNA叫单顺反子

2、原核细胞mRNA具有核糖体结合位点，可以募集翻译机器

  • 核糖体结合位点（RBS）
    • 一般位于 密码子5'端 3~9bp内
    • 与核糖体 16S rRNA 的 3'端互补（5' CCUCCU 3'）
    • 某些原核细胞ORF缺乏RBS也能翻译，是因为ORF紧接着上一个ORF：翻译耦合translational coupling

3、真核细胞mRNA在5' 和 3' 被修饰，促进翻译

  • 真核mRNA的 5'帽是甲基化鸟嘌呤核苷酸
  • 可以募集核糖体结合
  • 核糖体向下游扫描，寻找AUG
  • 在某些mRNA中，起始密码子周围有些保守位点
    • 5'- G/ANNAUGG-3' Kozak序列：与起始tRNA互作
    • 3' poly-A 尾： 增强5'Cap 的募集作用
    • 帽和尾 稳定RNA

二、转运RNA

1、tRNA是密码子与氨基酸之间的转配器

　　特征

  • 3'端均为5'-CCA-3' ：氨基酸结合位点
  • 存在特殊碱基：
     
    • ΨU 假尿嘧啶
    • D 双氢尿嘧啶
    • H 次黄嘌呤
    • T胸腺嘧啶
    • Gm 甲基鸟嘌呤

2、共有三叶草二级结构

  • 受体臂
  • ΨU loop
  • D loop
  • anticodon loop
  • variable loop

3、tRNA具有L形三维结构

三、氨基酸连接到tRNA上

1、氨基酸通过高能酰基连接到tRNA 3'端腺苷酸上使tRNA负载

  • 腺苷酰基化 adenylylation（ATP）
  • tRNA负载

2、每种氨酰-tRNA合成酶连接一种氨基酸到一种或多种tRNA上

　　每个氨基酸对应一种合成酶

  • 特殊的合成方式：Glu合成到tRNAGln，Glu在氧化成Gln

3、tRNA合成酶识别位于同族（cognate）tRNA上独特结构特征

  • 受体臂上鉴别者碱基
  • 反密码子环

4、保证氨酰-tRNA合成的精确

  • 酶口袋的尺寸阻止大氨基酸进入
  • 酶中的编辑口袋水解尺寸过小的氨基酸
  • 那么只有正确的氨基酸能合成

5、核糖体不能辨别tRNA的负载是否正确

6、硒代半胱氨酸

  • 存在于谷胱甘肽过氧化物酶，甲酸盐脱氢酶
  • 由UGA终止密码合成：特殊地机制


四、核糖体

  • DNA复制速度 200~100bp/s
  • 转录速度 50~100bp/s
  • 翻译 原核 20AA/s   真核 2~4AA/s

1、核糖体由一个大亚基，一个小亚基组成

  • 大亚基：肽基转移酶中心 peptidyl transferase center
  • 小亚基：解码中心 decoding center
  • 大小亚基按照沉降速录命名（不和质量成严格正比）

2、核糖体循环

 

  • 合成方向 N->C
  • 形成肽键的过程：将正在延伸的多肽转移到另一个tRNA上
  • 肽键的形成不需NTP水解：氨酰-tRNA储存着能量

3、核糖体RNA是核糖体中结构和催化功能决定因子

  • 以RNA为中心

4、核糖体有3个tRNA结合位点

  • A 氨酰tRNA结合
  • P 肽酰tRNA结合
  • E tRNA离开位点

5、核糖体内的通道使mRNA与延伸多肽进出

五、翻译的起始

  • 核糖体募集
  • 负载tRNA置于核糖体P位点
  • 核糖体精确定位

1、原核细胞

  • 三种起始因子指导 mRNA 和 tRNA 装配起始复合物
    • IF1 结合到A位点，防止起始tRNA结合
    • IF2 GTP酶，促进起始fMet-tRNAifMet结合至P位点，阻止别的结合
    • IF3 与小亚基结合，阻止翻译起始前大亚基结合（最后结合）
  • 随着起始因子的加入，小亚基准备好和mRNA，tRNA以任意顺序结合
    • 与mRNA结合：RBS 与 16S RNA相互作用
      • 结合后，起始密码子正好处于P位点
    • 起始 fMet-tRNAifMet 的结合：通过GTP与IF2相互作用
      • 起始的Met被加上甲酰基（Met-tRNA转甲酰酶） ：f-N -> C
    • 起始密码子与起始tRNA配对：小亚基构象变化，IF3释放
    • 大亚基结合（IF2作为初始对接位点），形成70S 起始复合体
    • IF2、IF1 释放
  • 许多蛋白质不是以Met开始的，氨肽酶通常会在氨基酸切除Met及另外一两个氨基酸 

2、真核细胞

  • 真核细胞中tRNA结合先于mRNA的结合
  • 使用另一组辅助因子
  • 核糖体小亚基结合上mRNA 的 5'Cap，扫描AUG（ATP)
  • 扫描到AUG后，组装大亚基，开始翻译
  • 翻译起始因子使真核mRNA保持环状：提高翻译效率

 

 

 

 

六、翻译的延伸

  • 氨酰-tRNA结合上A位点：EF-Tu-GTP辅助
  • 延伸：肽酰转移酶将多肽链加到A位点负载tRNA上
  • 易位
  • 在两种延伸因子的辅助下，正确的阅读ORF

氨酰tRNA结合

1、氨酰-tRNA由延伸因子EF-Tu送达A位点

  • EF-Tu-GTP覆盖tRNA3'端的氨基酸：防止过早反应
  • 正确匹配结合上A位点后，大亚基的某结构域激活GTP水解
  • EF-Tu-GDP释放

2、核糖体利用多种机制排斥错误配对的 氨酰-tRNA

  • 小亚基 16S RNA的两个碱基识别 tRNA-mRNA 之间的小沟：错配小沟形状不符合
  • EF-Tu-GTP=tRNA复合物要处于正确位点，才能导致GTP水解
  • 易位时，错误配对的tRNA容易脱落

肽键的形成

3、核糖体是一种核酶

  • rRNA处于活性中心，蛋白起辅助作用
    • 熵催化 entropic catalysis
    • rRNA通过碱基配对，将底物稳定在活性中心已促进反应
  • 底物辅助催化
    • P 位点 tRNA 的 2'OH 通过质子穿梭机制辅助催化

易位

4、肽键的形成启动大亚基中的易位反应

  • 大亚基的易位先于小亚基

5、EF-G推动易位

  • EF-G-GTP结合在大亚基上
  • EF-G-GTP水解形成EF-G-GDP 构象改变，占据A位点
  • 推动小亚基中的易位
  • 多米诺骨牌似的使得P位的tRNA易位向E
  • 稀有移码tRNA（4bp）补偿移码错误

　　EF-G-GTP 的 分子拟态：

  • EF-G-GTP 的形态很像 EF-Tu-GTP=tRNA复合物

6、EF-Tu-GDP 和 EF-G-GDP 在新一轮延伸前，要将GDP换成GTP

  • EF-Ts促进 GDP与 EF-Tu解离
  • EF-G 与 GDP亲和力<GTP亲和力，直接换

　　

7、形成肽键的一个循环消耗两个GTP，一个ATP

  • 氨酰-tRNA的形成 1ATP
  • EF-G-GTP 牵引氨酰tRNA正确匹配 1GTP
  • EF-G-GDP推动易位 1GTP

翻译的延伸中，原核与真核很相似

EF-Tu ：eEF1

EF-G  ：eEF2

七、翻译的终止

1、释放因子在终止密码子的作用下终止翻译

  • 核糖体循环在 终止密码子进入 A 位点后，就停止
  • 终止密码子被释放因子识别 release factor
  • 两类释放因子
    • I 类释放因子识别终止密码子：RF1 、RF2
    • II 类释放因子：释放肽链后，刺激 I 类因子从核糖体解离

2、I 类因子的一小段区域识别终止密码子，并催化多肽链的释放

  •  I 类释放因子上的肽反密码子识别终止密码子
  •  I 类释放因子的GGQ序列促进了多肽链的释放
  •  I 类释放因子功能上模仿了tRNA

3、II 类释放因子的功能受GTP、GDP调控

4、核糖体循环因子模仿tRNA

  • 核糖体循环因子（RRF）识别结合A位点
  • EF-G-GTP结合核糖体，GTP水解，占据A位点，促使RRF易位至P
  • 两个tRNA脱落
  • IF3 加入 EF-G-GDP脱落

八、翻译的调控

  • 翻译主要在起始阶段调控

1、蛋白质或RNA在RBS附近结合负调控细菌翻译的起始

  • RNA分子的配对会被核糖体打破，后续的核糖体可以识别

2、原核翻译调控：核糖体蛋白是其自身结合翻译的抑制因子

  • 原核核糖体蛋白基因的协同调控通过若干操纵子得以简化
  • 核糖体蛋白翻译的自我抑制：
    • rRNA充足时，核糖体蛋白首先结合rRNA
    • rRNA缺乏，核糖体蛋白结合自己的mRNA RBS附近
    • 阻止翻译

 3、真核翻译总体调节因子以mRNA识别及起始tRNA结合所需关键因子作为靶标

  • mTor因子对4E-BP的磷酸化与翻译的调控
    • 磷酸化的4E-BP不能结合5'Cap，翻译进行
    • 这是化疗药物的靶点 雷帕霉素

4、对mRNA特异的4E-BP进行翻译空间的调控

  • 果蝇卵母细胞护送Oskar mRNA从前向后运输

 5、铁离子调控转铁蛋白翻译

6、酵母转录激活因子Gcn4 的翻译受到上游短ORF及三元复合物丰度的调控

  • Gcn基因上游4个小的可读框
  • 翻译完第一个可读框的核糖体剩下一个小亚基在mRNA上
  •  氨基酸充足，因素介导，小亚基迅速结合三元复合物，寻找下一个ORF起始密码
  • 氨基酸缺乏时，小亚基结合三元复合物变慢，小亚基移出小ORF区后，才结合上，识别下游Gcn4基因起始密码，翻译

多聚核糖体谱

  • 被核糖体结合多的就是翻译活跃的

九、依赖翻译的mRNA和蛋白质稳定性调节

  •  mRNA会出错，但在翻译中被识别出来之前，它是稳定的

1、原核生物

  • 缺乏终止密码子
  • 核糖体在3'末端停滞，A位空缺
  • SsrA RNA 加入A位点
  • 类似正常的转肽和易位反应，将前面的tRNA和mRNA踢出
  • SsrA RNA加入后翻译出来的多肽带有10个氨基酸的标签，招募蛋白将其降解

2、真核生物

① 无意义密码子介导的mRNA衰减

  • 真核生物mRNA经过剪接后，会留有 外显子拼接复合物
  • 正常的翻译，核糖体会将一路上的 拼接复合物清除
  • 如果提前终止了，就有 拼接复合物无法清除
  • 招募5'->3'、3'->5'外切酶清除mRNA

② 无终止密码子介导衰减

  • 真核mRNA以poly-A结尾
  • 无终止密码子，会翻译出尾端的多个 AAA（赖氨酸）
  • 招募降解mRNA 和 蛋白质

③ 末端终止介导的衰减 no-go decay

  • 当核糖体因为二级结构，或者相关tRNA不够用时，停滞，招募降解

十、遗传密码

1、遗传密码的简并性

  • 密码子第一位改动改变氨基酸
  • 第二位：嘧啶往往疏水；嘌呤往往极性
  • 第三位：较少会发生氨基酸的改变

2、遗传密码的摆动性

反密码子

密码子

G

U 、C

C

G

A

U

U

A、G

I

A、U、C

3、遗传密码遵循3条规律

  • 5'->3' 阅读
  • 密码子不重叠，信息间不重叠
  • 固定可读框上翻译

4、突变与抑制突变

  • 错义突变
  • 终止突变
  • 移码突变
  • 一个碱基缺失导致移码突变：可以由随后增加一个碱基的突变补偿
  • 因为突变产生的提早的终止子可以被特殊的tRNA抢先读取，

5、遗传密码几乎通用

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