数据分析与解读
1. Data Cleaning
从原始数据（Raw Data）到干净数据（Clean Data）的过程，有人翻译成“数据清洗”，实在叫不习惯
Illumina测序仪下机的数据通常为Bcl格式，是将同一个测序通道（Lane）所有样品的数据混杂在一起的，所以公司一般不会提供Bcl文件。测序公司使用Illumina官方出品的Bcl2FastQ软件，根据Index序列分割转换成每个样品的FastQ文件，打开长这样：
原始数据没法直接分析，是因为部分reads测序质量较低，可能会误导后续结果，因此需要对低质量碱基太多或N（未能识别的碱基）太多的reads进行去除；此外，部分测序文库的插入片段太短，导致测到两侧的接头序列，这些序列接头也需要从reads中去除。最后，我们也会对清洗前后的Raw Data和Clean Data进行评估，评估内容包括碱基质量、序列长度、碱基比例、GC含量、重复序列、Kmers等
#常用软件#
我以前都是用cutadapt + FASTX-Toolkit的组合，直到同事们给我推荐了Trim Galore，质量评估使用FastQC
1.5 #可选步骤# 核糖体RNA（rRNA）去除
2. 比对
如果不是很急或者只想知道已知转录本表达量，个人建议使用基因组比对的方法进行分析，理由如下：
① 转录组比对需要准确的已知转录本的序列，对于来自未知转录本（比如一些未被数据库收录的lncRNA）或序列不准确的reads无法正确比对；
② 与上一条类似，转录组比对不能对转录本的可变剪接进行分析，数据库中未收录的剪接位点会被直接丢弃；
③ 由于同一个基因存在不同的转录本，因此很多reads可以同时完美比对到多个转录本，reads的比对评分会偏低，可能被后续计算表达量的软件舍弃，影响后续分析；
④ 由于与DNA测序使用的参考序列不同，因此不利于RNA和DNA数据的整合分析。
此外，值得注意的是，RNA测序并不能直接使用DNA测序常用的BWA、Bowtie等比对软件，这是由于真核生物内含子的存在，导致测到的reads并不与基因组序列完全一致，因此需要使用Tophat/HISAT/STAR等专门为RNA测序设计的软件进行比对
比对结果会展示为BAM/SAM文件，其中BAM格式是SAM格式的二进制版本
BAM文件中每行代表一条reads的比对信息，其中第一列是read的ID，第二列为FLAG（包括是否双端比对，比对位点是否唯一等信息），第三列为比对的染色体，第四列为比对的起始位置，第六列为CIGAR值，代表比对的具体方式（例60M2D80M代表60个碱基完美匹配+2个碱基缺失+80个碱基完美匹配）等等
#常用软件#
基因组比对：
Tophat2：可以说是最被公认的RNA测序比对软件（实际上是在DNA比对软件Bowtie的基础上做了一个壳），相信很多做RNA测序的同学都是看着Tophat发表在Nature Protocol上的步骤一步步入门RNA测序的；
HISAT2：Tophat2的非正式升级版本（因为据说还会有Tophat3），在Tophat的算法基础了上做了大量的改进，而且克服了Tophat最大的缺点——速度慢，Nature Protocol上同样发表了操作流程；
STAR：ENCODE计划御用比对软件，权威程度可以与Tophat平起平坐，并且比对速度极快；
MapSplice：TCGA使用的比对软件，我自己没用过；
RSEM：RSEM更像一个软件包而不是一个比对软件，能够提供从比对到计算差异表达的所有步骤，由于不需要自己写代码串联不同软件生成的数据格式，因此用起来比较省时省力，值得注意的是，TCGA使用MapSplice比对后再用RSEM计算表达量，并没有直接只用RSEM原装的Bowtie的比对结果。
转录组比对：这类型的软件我用的不多，最近尝试过Nature Methods上面发表的Salmon，能从Clean reads直接算到表达量，优点是，快，非常快。然而这个软件连BAM文件都没生成，虽然只是定量的话BAM文件的确没什么用就是了…